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近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線發(fā)表了由寧波大學(xué)陳劍平/燕飛課題組聯(lián)合湖南大學(xué)于峰團(tuán)隊完成的題為“A plant viral effector subverts FER-RALF1 module-mediated intracellular immunity“論文。該研究揭示了茄科植物中，NbRALF1和NbFER在胞內(nèi)互作，激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)及調(diào)控抗病激素代謝，負(fù)向調(diào)控RNA病毒感染。同時，病毒為成功侵染，其編碼的6K2蛋白利用植物泛素化途徑降解NbRALF1，從而抑制NbRALF1-NbFER介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這一成果不僅揭示了小肽及其受體激酶調(diào)控宿主免疫的新機制，還為深入理解病毒與寄主間相互作用的分子機制提供了新的視角。

小肽在植物和環(huán)境互作中發(fā)揮重要作用，其中快速堿基化因子（rapid alkalinization factors, RALFs）是植物分泌的一類大小約為5 kDa的小肽，在植物適應(yīng)不斷變化的環(huán)境過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Murphy et al., 2012）。RALF 屬于富含半胱氨酸的植物肽類激素家族，在多種生理和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其功能范圍廣泛，從植物生殖和發(fā)育到免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等（Abarca et al., 2021; Haruta et al., 2014; Stegmann et al., 2017; Cheung, 2024）。受體樣激酶FERONIA（FER）是長春花屬植物RLK1（CrRLK1L）家族的典型成員，其功能是在RALF作用下調(diào)節(jié)免疫受體激酶復(fù)合體的形成（Stegmann et al., 2017; Xiao et al., 2019; Li et al., 2016）。通常，F(xiàn)ER的胞外域識別成熟的RALFs以對抗細(xì)菌和真菌感染（Cheung, 2024; Kwon et al., 2024; Guo et al., 2018；Chen et al., 2024；He et al., 2023）。RALF肽家族最初因能使煙草（N. tabacum）的胞外介質(zhì)快速堿化并激活MAPK通路而被發(fā)現(xiàn)，但我們對其在植物免疫中的作用和機制仍了解有限。相應(yīng)地，真菌和細(xì)菌基因組中也鑒定出了潛在的RALF肽，可模擬植物RALFs，激活寄主植物FER激酶，抑制寄主基礎(chǔ)免疫，從而增強病原的致病力（Masachis et al., 2016; Thynne et al., 2017; Zhang et al., 2020；Wang et al., 2024）。然而，F(xiàn)ER-RALF信號級聯(lián)在植物病毒感染中是否發(fā)揮作用尚缺乏理解。近日，寧波大學(xué)陳劍平院士、燕飛研究員課題組聯(lián)合湖南大學(xué)于峰教授團(tuán)隊以蕪菁花葉病毒（TuMV，potyvirus最大類群的代表病毒）及本氏煙（Nicotiana benthamiana，Nb）為模型，合作揭示了茄科植物中FER-RALF信號通路調(diào)控宿主免疫及與RNA病毒互作的新機制。全文主要研究結(jié)果如下：

1. NbRALF1抑制多種RNA病毒對本氏煙的侵染

選取研究較為透徹的擬南芥RALF1和RALF23在本氏煙的同源基因，NbRALF1過表達(dá)能夠顯著抑制TuMV的局部侵染，而NbRALF23不影響TuMV侵染（圖一）。NbRALF1轉(zhuǎn)錄本受TuMV侵染顯著上調(diào)表達(dá)。敲除NbRALF1基因，抑制TuMV對本氏煙的侵染。對另外兩種植物RNA病毒：辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus, PMMoV）和馬鈴薯X病毒（potato virus X, PVX），均表現(xiàn)負(fù)調(diào)控侵染的作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，NbRALF1誘導(dǎo)MAPK（mitogen-activated protein kinases）信號途徑，植物與病原物互作途徑和植物激素信號傳導(dǎo)途徑等相關(guān)基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明，NbRALF1誘導(dǎo)宿主基礎(chǔ)免疫相關(guān)途徑基因的表達(dá)，抵御多種RNA病毒的侵染。

圖一 NbRALF1負(fù)調(diào)控TuMV的侵染

2. NbRALF1抑制TuMV侵染依賴完整的蛋白，而不是其成熟的狀態(tài)。

已知擬南芥中RALF前體的RRXL基序可被S1P蛋白酶切割形成成熟的RALF，YIXY基序與細(xì)胞膜上受體激酶FER胞外域結(jié)合激活免疫。氨基酸序列分析結(jié)果表明，NbRALF1具有RRIL、YISY和C端4個保守的半胱氨酸基序（圖二）。突變RRIL和YISY基序不影響NbRALF1抑制TuMV侵染的能力，而突變C端4個保守的半胱氨酸基序則導(dǎo)致NbRALF1抑制TuMV侵染的能力喪失，暗示NbRALF1抗病毒侵染不依賴于成熟的RALF。進(jìn)一步通過體外合成成熟的RLAF肽噴施處理本氏煙，發(fā)現(xiàn)其不能激活免疫，也不能抑制病毒侵染。這些結(jié)果表明NbRALF1介導(dǎo)免疫和抗病毒功能不依賴于成熟的RALF。

圖二 NbRALF1及其突變體對TuMV侵染本氏煙的影響

3. NbRALF1抑制TuMV侵染依賴其受體NbFER

RALF激活免疫是通過成熟的RALF與受體激酶的胞外域結(jié)合，受體激酶磷酸化下游靶標(biāo)誘導(dǎo)的。擬南芥中RALF1的受體是FER，為了驗證本氏煙受體激酶是否參與病毒侵染過程，這項研究克隆了NbFER基因，發(fā)現(xiàn)NbRALF1抑制TuMV侵染的能力依賴于NbFER及其磷酸化功能。在共表達(dá)NbRALF1和NbFER時，發(fā)現(xiàn)本氏煙葉片發(fā)生壞死表型，且誘導(dǎo)壞死的能力也依賴于NbFER的磷酸化功能，而不依賴于NbRALF1的RRIL和YISY基序。為解析這些現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)NbRALF1和NbFER能夠顯著誘導(dǎo)MAPK3/6磷酸化水平和免疫途徑相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)（圖三）。這些結(jié)果表明，NbRALF1-NbFER模塊能夠激活免疫，抑制TuMV侵染。

圖三 NbRALF1-NbFER級聯(lián)誘導(dǎo)免疫抑制病毒侵染

4. NbRALF1-NbFER模塊通過胞內(nèi)反應(yīng)介導(dǎo)免疫

前期結(jié)果表明，成熟的RALF肽不能激活免疫，證明本氏煙中NbRALF1-NbFER模塊誘導(dǎo)的免疫可能不依賴于成熟的RALF肽與NbFER的胞外域結(jié)合。但是，NbRALF1是否能夠進(jìn)入胞外空間仍需要證明。這項研究利用質(zhì)壁分離結(jié)合亞細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，全長NbRALF1能夠形成成熟的RALF1肽并進(jìn)入質(zhì)外體空間，構(gòu)建的成熟的RALF1也能夠進(jìn)入質(zhì)外體，并且TuMV侵染不影響NbRALF1的質(zhì)外體定位，這表明本氏煙中成熟的NbRALF1與NbFER不能夠誘導(dǎo)免疫。為了解析NbRALF1與NbFER誘導(dǎo)免疫的機制，本研究鑒定了NbRALF1與NbFER互作的關(guān)鍵域，發(fā)現(xiàn)NbRALF1的N端能夠與NbFER的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域互作，這可能是誘導(dǎo)胞內(nèi)免疫的關(guān)鍵（圖四）。這些結(jié)果表明，盡管成熟的NbRALF1能夠進(jìn)入細(xì)胞外空間，和NbFER胞外互作，但不能誘導(dǎo)免疫，相反，NbRALF1與NbFER誘導(dǎo)免疫可能是通過胞內(nèi)互作反應(yīng)激活。

圖四 NbRALF1與NbFER胞內(nèi)識別

5. 6K2靶向降解NbRALF1抑制免疫

為了解析TuMV如何突破NbRALF1-NbFER模塊介導(dǎo)的免疫，篩選與NbRALF1互作的病毒蛋白，發(fā)現(xiàn) TuMV編碼的6K2和VPg都能夠與NbRALF1相互作用，并且6K2能夠利用泛素化途徑誘導(dǎo)NbRALF1降解，而VPg對NbRALF1蛋白穩(wěn)定性無影響。6K2還能夠顯著減輕NbRALF1和NbFE誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死（圖五）。這些結(jié)果表明，TuMV編碼6K2蛋白利用植物泛素化途徑降解NbRALF1，抑制NbRALF1-NbFER模塊介導(dǎo)的免疫和壞死，促進(jìn)自身侵染。

圖五 TuMV 6K2靶向降解NbRALF1

圖六 植物基礎(chǔ)免疫與RNA病毒之間的博弈的工作模型

本研究聚焦于小肽NbRALF1及受體激酶NbFER在植物免疫中的作用機制（圖六）。一方面，在病毒侵染時，NbRALF1與NbFER在胞內(nèi)互作，激活免疫反應(yīng)以抵御病毒侵染，揭示了膜上受體激酶誘導(dǎo)免疫抑制病毒的新途徑；另一方面，TuMV通過編碼6K2蛋白，借助植物泛素化途徑降解NbRALF1，破壞NbRALF1-NbFER模塊觸發(fā)的免疫，為植物病毒抑制膜上受體蛋白誘導(dǎo)免疫提供了新見解。這一發(fā)現(xiàn)闡明了植物基礎(chǔ)免疫與RNA病毒之間的相互博弈關(guān)系，為未來抗病毒策略的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

寧波大學(xué)植物病毒學(xué)研究所陳劍平院士、燕飛研究員和吳官維副研究員為論文通訊作者，寧波大學(xué)和福建農(nóng)林大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生芮鵬環(huán)為論文第一作者。湖南大學(xué)于峰教授參與該研究。上海交通大學(xué)陳煥教授、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)程曉非教授和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院李方方研究員對該工作提供了寶貴建議。中國科學(xué)院華南植物園陳琛研究員為該研究提供了實驗材料支持。該研究得到了浙江省自然科學(xué)基金和國家自然科學(xué)基金等項目的支持。

論文鏈接：http://doi.org/10.1111/pbi.70099